Localización
- Edificio de Apoyo a la Investigación (CACTUS)
- Rúa de Constantino Candeira, 1. Campus Vida , 15782Santiago de Compostela
- Teléfonos
- 881 816 242
Las proteínas se digieren con una enzima, normalmente tripsina (proteasa que rompe específicamente en los residuos arginina y lisina si no van unidas a una prolina), para el posterior análisis por espectrometría de masas de los péptidos obtenidos.
- Digestión en gel: se emplea el Kit de la casa Millipore (In-Gel DigestZp kit) para digerir proteínas resueltas vía electroforesis 1D el 2D y de geles teñidos con comassie, plata o fluorescencia.
- Digestión en solución: se realizan digestiones trípticas de muestras en solución.
- Proteínas en gel. Se enviarán las bandas de gel (1-4 mm), en un tubo eppendorf en agua milli-Q, con el nombre de las muestras indicado. Las bandas serán recortadas del gel adaptándose estrictamente a su contorno, con el fin de no incrementar la proporción de acrilamida en la muestra. Se seguirán las recomendaciones indicadas en el apartado de la preparación de la muestra. Cuanto mayor sea la cantidad de la proteína presente en la mancha, más fácil resultará identificarla, ya que solo una parte se recuperará para el análisis en el espectrómetro de masas. Con el kit de Millipore se pueden obtener buenos resultados con 100 fmoles de proteína de partida.
- Proteínas en disolución. Se enviarán las proteínas (1-10µg) en un tubo eppendorf, con el nombre de las muestras indicado. Se seguirán las recomendaciones indicadas en el apartado de la preparación de la muestra. Las muestras se entregarán en la Unidad de Masas y Proteómica, junto con la solicitud debidamente cumplimentada y una imagen del gel del que proceden las muestras para analizar (en el caso de que las proteínas se hicieran en gel).
- Almacenamiento de los geles: Los geles pueden conservarse húmedos durante algunas semanas en ácido acético al 1 % a 4 °C. Las bandas recortadas del gel pueden almacenarse congeladas en agua o ácido acético al 1 %. Los geles secos pueden ser válidos, mismo después de varios años de conservación, siempre que sus superficies no fueran contaminadas con huellas o polvo, en los que se encuentren queratinas. Con todo, es mejor trabajar con geles húmedos libres de recubrimientos de plástico o celulosa.
- Geles compatibles:
- Tipos de geles: Puede ser válido cualquier tipo de gel de poliacrilamida, siendo fundamental que su grosor se encuentre entre 1 y 1.5 mm y que el porcentaje de acrilamida (que se puede usar en este kit) sea del 4-20 %. El tamaño de la pieza del gel sería de 1-3 mm de diámetro para geles 1D y de 1-2 mm de diámetro para geles 2D. Debe tenerse especial precaución en no introducir en el gel sustancias extrañas que puedan intervenir en el análisis mediante espectrometría de masas. De esta manera, para evitar la presencia de restos de acrilamida no polimerizada, es aconsejable prolongar la polimerización toda una noche.
- Métodos de tinción: Comassie, plata (evitar emplear Glutaraldehido), fluorescencia.
- Reactivos compatibles con Espectrometría de Masas:
- Disolventes: Emplear reactivos de grado de pureza para HPLC y agua milli-Q.
- No interfiren: TFA, ac. fórmico, Beta-Mercaptoetanol, DTT, solventes orgánicos volátiles, HCL, NH4OH, ac. acético.
- Tolerables en una concentración menor a la indicada:
- < 2M: Urea Guanidina
- < 50mM: HEPES, MOPS, Tris, NH4O, Ácido Octyl glucosido.
- < 10mM: Fosfatos
- <1 %(V/V): Glicerol, n-octil-b-glucopiranosido, LDAO
- <0.1 %(V/V): Azida sódica, PEG2000, Triton X-100, RTX-100, NP-40, Tween, Zwitte.
- < 0.01 %(V/V):SDS, CHAPS.
- A Evitar: DMSO, DMF, NaOAc, NaCL.
- Manipulación de muestras y geles: las superficies y el material deben estar perfectamente limpios. Para la escisión se puede emplear un bisturí y unas pinzas, o una punta desechable convenientemente recortada, teniendo siempre cuidado de que este material se encuentre completamente limpio.
- Contaminación por queratinas: Es esencial trabajar con la mayor limpieza posible, ya que la incorporación de las proteínas contaminantes dificultan o impiden la identificación de la proteína de interés. Los contaminantes más frecuentes son la seroalbúmina bovina y las queratinas humanas, estas últimas abundan en el polvo, las huellas dactilares y el cabello. Por esta razón habrá que poner especial énfasis en la limpieza de los cristales que se empleen en la electroforesis y emplear soluciones de tintura frescas. Nunca se debe tocar el gel con los dedos, bisturís o pinzas, y cualquier material, que se emplee para recortar las manchas, debe ser limpiado.
Unidad de Espectrometría de Masas y Proteómica
- Edificio de Apoio á Investigación (CACTUS)
- Rúa de Constantino Candeira, 1. Campus Vida , 15782Santiago de Compostela
- 881 816 242