Dixestión

As proteínas dixírense cunha enzima, normalmente tripsina (Proteasa que rompe especificamente nos residuos Arxinina e Lisina se non van unidas a unha prolina), para a posterior análise por espectrometría de masas dos péptidos obtidos. 

Tipos de dixestión:

• DIXESTIÓN EN XEL: emprégase o Kit da casa Millipore (In-Gel DigestZp kit) para dixerir proteínas resoltas vía electroforese 1D o 2D e de xeles tinguidos con Coomassie, Prata ou fluorescencia.
• DIXESTIÓN EN SOLUCIÓN: realízanse dixestións trípticas de mostras en solución.

Tipo de Mostras:

• En Disolución. Enviaranse as proteínas (1-10µg) nun tubo eppendorf, co nome das mostras indicado.
• En Xel. Enviaranse as bandas de xel (1-4 mm), nun tubo eppendorf en auga milli-Q. As bandas serán recortadas do xel adaptándose estritamente ao seu  contorno, co fin de non incrementar a proporción de acrilamida na mostra.

Almacenamento dos xeles: Os xeles poden conservarse húmidos durante algunhas semanas en ácido acético ao 1% a 4ºC. As bandas recortadas do xel poden almacenarse conxeladas en auga ou acedo acético ao 1%. Os xeles secos poden ser válidos, mesmo despois de varios anos de conservación, sempre que as súas superficies non fosen contaminadas con pegadas ou po, nos que se atopen queratinas. Pero é mellor traballar con xeles húmidos libres de recubrimentos de plástico ou celulosa.

Xeles compatibles:

• Tipos de Xeles: Pode ser válido calquera tipo de xel de poliacrilamida, sendo fundamental que o grosor dos mesmos se atope entre 1 e 1.5 mm e que a porcentaxe de acrilamida (que se pode usar neste kit) sexa do 4-20%. O tamaño da peza do xel sería de 1-3 mm de diámetro para xeles 1D e de 1-2 mm de diámetro para xeles 2D. Debe terse especial precaución en non introducir no xel substancias estrañas que poidan intervir na análise mediante espectrometría de masas. Desta maneira, para evitar a presenza de restos de acrilamida non polimerizada, é aconsellable prolongar a polimerización toda unha noite.
• Métodos de tintura: Coomassie , Prata (evitar empregar Glutaraldehido), Fluorescencia.

Manipulación de mostras e xeles: as superficies e o material debe estar perfectamente limpo. Para a escisión pódese empregar un bisturí e unhas pinzas, ou unha punta refugable convenientemente recortada, tendo sempre coidado de que o devandito material se atope completamente limpo.

Reactivos compatibles con Espectrometría de masas:

Contaminación por queratinas: É esencial traballar coa maior limpeza posible, xa que a incorporación das proteínas contaminantes dificulta ou impide a identificación da proteína de interese. Os contaminantes máis frecuentes son a seroalbúmina bovina e as queratinas humanas, estas últimas abundan no po, as pegadas dactilares e o cabelo. Por esta razón haberá que poñer especial énfases na limpeza dos cristais que se empreguen na electroforeses e empregar solucións de tintura frescas. Nunca tocar o xel cos dedos, bisturís ou pinzas e calquera material que se empregue para recortar as manchas, débense limpar.

Instrumentación: Kit de Millipore con microplacas C18, ThermoMixer (Millipore).