Para conseguir un proceso de ionización eficiente y suave en esta técnica, se deben cumplir tres condiciones básicas:
- La ionización debe ser resonante. La longitud de onda del láser debe ser acomodada para conseguir la excitación electrónica o vibracional de la molécula. Para ello, se emplean láseres con emisión en el espectro ultravioleta o infrarrojo remoto, respectivamente.
- El punto caliente producido debe ser de muy corta duración, para evitar la descomposición térmica de la molécula. Por lo tanto, se emplea un láser con pulsos de muy corta duración (de 1 a 100 nanosegundos).
- La muestra debe mezclarse previamente con una matriz (normalmente líquida), que suenen ser moléculas orgánicas pequeñas que, con la evaporación del disolvente, forma cristales con la muestra. De esta manera, las moléculas del analito quedan aisladas entre sí y rodeadas de un gran número de moléculas de matriz, evitando la probable asociación y formación de complejos entre moléculas de analito de muy alto peso molecular y difíciles de desorber y analizar. Además, la función principal de la matriz es absorber el exceso de energía, dando lugar a una ionización extremadamente suave. Con esa absorción de energía, a matriz la convierte en energía de excitación y se produce la transferencia de iones H+ a la muestra (ionización), dando lugar a especies monocargadas.
Esta técnica se combina con un analizador TOF (Time of Flight o Tiempo de Vuelo). Su principio es el siguiente: Una vez introducida la muestra en la fuente del equipo con la matriz en una placa de MALDI (de acero), se produce un pulso intensivo de disparos láser de longitud de onda corta que provocan la ionización del analito. Una vez conseguida la ionización y confinados todos los iones en la fuente, se aplica un voltaje de extracción, consiguiendo que todos los iones salgan de la fuente de manera simultánea. Seguidamente, pasan por un campo electrostático acelerador, adquiriendo una elevada energía cinética que los impulsa en la dirección del tubo de vuelo hacia el detector. Los iones de mayor m/z volarán la menor velocidad que los de menor m/z, por lo que estos últimos (los más pequeños) alcanzarán primero el detector, y serán seguidos en el tiempo, de manera sucesiva, por los de mayor tamaño (siempre y cuando tengan la misma carga).
El tiempo empleado en recorrer la longitud del tubo de vuelo será proporcional a la masa o relación masa/carga de los iones, y el sistema de detección será más capaz de distinguir, o diferenciar, las diferentes masas iónicas cuanto mayor sea la separación de los iones en el tiempo, mayor sea el tubo de vuelo (que por su construcción es considerado un valor fijo) o menor sea la dispersión de energías de los iones formados en la fuente. Para compensar esta dispersión y mejorar la resolución del espectro de masas, se emplea un dispositivo llamado reflectrón, que reenfoca los iones de la misma masa (ata unos 5 KDa) sobre el detector. De esta manera, los equipos MALDI pueden trabajar en dos modos: modo lineal (baja resolución) para moléculas mayores de 5 KDa, y modo reflectrón (alta resolución) para moléculas menores de 5 KDa.
Las matrices se emplean dependiendo del tipo de analito a medir. Las matrices con las que cuenta, actualmente, y que son las más habituales en MALDI, son las siguientes:
| Nombre | Abreviatura | Analitos |
|---|---|---|
| Ácido α-ciano-4-hidroxicinámico | HCCA | Péptidos Proteínas (< 5 KDa) |
| Ácido sinapínico | SA | Proteínas (10-150 KDa) Péptidos (> 3 KDa) |
| Ácido 2,5-dihidroxibenzoico | DHB | Péptidos Proteínas Polímeros Hidratos de carbono Lípidos/Glicolípidos |
| 1,8,9-trihidroxiantraceno (Dithranol) | DIT | Polímeros no polares |
| Trans-2-[3-(4-tert-Butilfenil)-2-metil-2-propenilideno]malonitrilo | DCTB | Analitos no polares |
Para otro tipo de matrices, contacte con la unidad de servicio.
Tipo de muestra para MALDI
La técnica MALDI se usa en análisis de péptidos, carbohidratos, oligonucleótidos, polímeros sintéticos, organometálicos, compuestos orgánicos e inorgánicos, proteínas, glicoproteínas, polinucleótidos, oligosacáridos y glicolípidos.
Unidad de Espectrometría de Masas y Proteómica
- Edificio de Apoio á Investigación (CACTUS)
- Rúa de Constantino Candeira, 1. Campus Vida , 15782Santiago de Compostela
- 881 816 242